Qué es la inmunofluorescencia?
¿Qué es Inmunofluorescencia?
La inmunofluorescencia es una técnica utilizada para visualizar la distribución de una proteína o antígeno específico en células o secciones de tejido utilizando la especificidad de los anticuerpos por su antígeno para dirigir marcadores fluorescentes a las biomoléculas dianas de forma específica. La inmunofluorescencia es un ejemplo del uso del inmunomarcaje, y una aplicación es la inmunohistoquímica que hace uso de marcadores fluorescentes para visualizar y localizar los anticuerpos y a su vez, los antígenos, en células o secciones del tejido.
Hay dos tipos principales de métodos de marcaje en inmunofluorescencia: 1) el marcaje directo en el que el anticuerpo primario está marcado con un marcador fluorescente, y 2) el marcaje indirecto en el que un anticuerpo secundario marcado con un fluorocromo se utiliza para reconocer un anticuerpo primario. El marcaje inmunofluorescente se puede realizar en células fijadas sobre portaobjetos y en secciones de tejido. Las muestras marcadas inmunofluorescentemente se examinan bajo un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal.
Método de Marcaje Directo VS. Indirecto
- El método de marcaje directo, usando una unión covalente previa del fluoróforo con el anticuerpo primario, sólo requiere una única etapa de incubación con el antígeno y una sola etapa de lavado. El marcador fluorescente generalmente produce una sustancia colorada o un aumento en la cantidad de luz emitida a una longitud de onda determinada, si el antígeno está presente. En el caso de ausencia de antígeno, no hay unión del anticuerpo primario marcado y por lo tanto no hay señal.
Figura 1 - Método Directo de marcaje de anticuerpo con marcador fluorescente. Bioconjugación con tecnología nitzipper®.
- El método de marcaje indirecto es un proceso más largo que el directo, ya que consiste en el uso de un anticuerpo primario no marcado que se une específicamente al antígeno diana, y el anticuerpo secundario, que lleva el fluoróforo, reconoce el anticuerpo primario y se une a él. Varios anticuerpos secundarios pueden unirse al anticuerpo primario y esto proporciona una amplificación de la señal mediante el aumento del número de moléculas de marcadores fluorescentes por antígeno.
Figura 2 – Método Indirecto de marcaje de anticuerpo con un marcador fluorescente. Bioconjugación con tecnología nitzipper®.| Método DIRECTO | Método INDIRECTO | ||
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| PROS | CONTRAS | PROS | CONTRAS |
| * Rápido porque sólo se usa un anticuerpo y se necesitan menos etapas.
*Unión específica del anticuerpo secundario (no hay reactividad cruzada). * Disminución de la variabilidad del ensayo y mejora de la calidad de los datos.
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* Falta de sensibilidad para detector bajos niveles de expresión del antígeno.
* Necesidad de marcar cada anticuerpo primario para cada antígeno de interés: consume tiempo y es costoso. *La inmunoreactividad del anticuerpo primario puede verse afectada adversamente por el marcaje. * No hay flexibilidad en la elección marcador del anticuerpo primario de un experimento a otro. * Amplificación de señal mínima. * Altos conocimientos científicos especializados requeridos.
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* Mayor nivel de sensibilidad y genera una señal más intensa.
* Una amplia variedad de anticuerpos secundarios marcados disponibles comercialmente. *Máxima inmunoreactividad del anticuerpo primario se mantiene, ya que no está etiquetado. *Mayor amplificación de la señal debido a la unión de varios anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario.
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